基于UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS、网络药理学和实验验证研究刺五加治疗急性高原脑水肿的作用机制
我国常居高原者超过1000万人，近年来，随着高原旅游业迅速发展，每年进入高原的流动人口超过2000万[1]。急进高原地区人员可因低氧低压、寒冷干燥等地理气候特点引发高原病，如急性高原病（AMS）、高原肺水肿（HAPE）、高原脑水肿（HACE）等[2]。其中，HACE是最严重的疾病之一。高原低压缺氧导致脑组织损伤、含水量增多所引起的脑体积增大和重量增加，进而出现脑功能障碍称为高原脑水肿[1]。HACE通常发生在快速上升到海拔3000 m以上的人群中，但也可能在较低海拔（2500 m）发生，并且发病更快[2]。在海拔4000～5000 m的人群中，HACE的发病率估计为0.5%～1.0%[3-4]。临床表现以严重头痛、呕吐、共济失调、进行性意识障碍为特征。HACE病情发展速度极快、病死率极高，严重威胁患者生命安全。如果不及时诊断和治疗，它可能会在24 h内迅速发展为昏迷和死亡[3]。
目前用于防治高原病的药物多为乙酰唑胺、地塞米松和硝苯地平等[4]。但这些药物对人体有明显的不良反应。例如，乙酰唑胺和硝苯地平会引起类似高原反应的症状，如头痛、恶心、呕吐、乏力；糖皮质激素会导致精神疾病，如焦虑、抑郁等[4]。因此，中草药可能是减少给药期间不良反应的有利药物。
刺五加是五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus（Rupr et Maxim.）Harms的干燥根和根茎或茎。其化学成分主要包括黄酮、三萜皂苷、有机酸、木脂素、香豆素、酚类和多糖[5]。研究表明，刺五加具有抗应激、抗氧化、抗炎以及治疗脑血管疾病的作用[6-8]。例如，刺五加具有抗脑缺血再灌注损伤的神经保护作用，可以减轻脑组织氧化和炎症引起的损伤[9]。此外，刺五加在治疗缺血性卒中中显示出显著的生物活性[10]。刺五加水提取物通过调节海马、吞噬体和PI3K/Akt途径等，对神经细胞的结构、分裂和吞噬作用具有积极的作用[11]，已经成为治疗小鼠大脑辐射损伤的一种有前途的替代药物[11]。此外，研究表明刺五加的主要活性成分刺五加苷B可以通过减轻铁死亡和坏死性凋亡来改善高原肺水肿[12]。因此，推测刺五加可能对高原脑水肿也有同样的治疗作用。
网络药理学是一门在生物网络背景下研究疾病和药物作用机制的新学科。网络药理学的核心概念——“网络靶点”，类似于中医的整体理论。目前，网络药理学被认为是研究中药有效成分和作用机制的一种很有前途的方法，为研究中医药相关问题提供了新的方法和机遇。网络药理学已广泛应用于中药有效成分和作用机制的研究，如红景天、赶黄草[13-14]。
因此，研究团队结合网络药理学，以UHPLC-LTQOrbitrap-MS分析所表征的成分为基础，探讨刺五加治疗高原脑损伤的药理机制。本研究应用网络药理学预测其作用机制，并通过分子对接和实验验证结果，为刺五加的开发利用提供了理论参考。
1.刺五加中化合物鉴定
图1为UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS下刺五加正负两种模式的总离子色谱图。通过分析，从刺五加共鉴定了30个化学成分，包括16个苯丙素类、7个黄酮类、6个有机酸类和1个其他化学成分。最终鉴定结果见表1。
图1 刺五加的TIC色谱图负离子模式下的总离子图（A）和正离子模式下的总离子图（B）
表1 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS鉴定的刺五加化学成分信息
2.刺五加的活性成分及治疗高原脑损伤的潜在靶点
通过结合多个数据库，删除重复和无效的靶点后共获得391个成分靶点与1276个疾病靶点。经韦恩图分析后得到106个交集靶点（图2A）。对药物成分和疾病基因构建“成分－靶点”相互作用网络图，如图2B。通过网络拓扑分析，得到度值前15位的核心成分，包括槲皮素、阿魏酸、刺五加苷B、奎宁酸和绿原酸等。
图2 维思图（A）和“成分－靶点”网络图（B）
3.蛋白质相互作用网络
将106个交集靶点导入String数据库进行分析，构建PPI网络，将数据导入Cytoscape进行可视化（图3），同时进行网络拓扑分析。最终分析表明，有49个关键靶点蛋白的度值高于中位数17，如AKT1、HIF1A、TNF、ALB和BCL2等。这些基因在度值和平均最短路径长度中排名靠前，表明这些基因在高原脑损伤的治疗中起着至关重要的作用。
图3 PPI网络图
4.GO和KEGG通路富集分析
对PPI网络中的核心靶点进行GO和KEGG通路富集分析。GO分析结果显示，GO功能富集共获得465个GO条目（P<0.05）。其中与生物过程（BP）有关的条目359个，前20个条目图4A所示。BP分析表明，潜在靶点主要集中在对外源性刺激的反应、miRNA转录的正调控、凋亡过程的调控和PI3K/Akt通路信号转导上。与细胞组成（CC）有关的条目30个，前20个条目如图4B所示，主要涉及细胞质、细胞溶质、细胞核和线粒体等。与分子功能（MF）有关的条目76个，前20条目如图4C所示。此外，MF分析表明，蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性和蛋白质结合在其中排名靠前。基于KEGG通路富集分析，共鉴定出126个通路，前20个条目如图4D所示。主要涉及癌症的发病途径、PI3K/Akt信号通路和AMPK信号通路等。将前20个结果可视化，气泡越大说明基因富集越多，气泡颜色越红说明P值越小。其中PI3K/Akt信号通路位居前列。
图4 生物过程（A）、分子功能（B）、细胞分析（C）和KEGG信号通路（D）
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