帕金森病（PD）是一种常见的与年龄相关的神经退行性疾病，以中脑黑质致密部多巴胺能神经元进行性大量丢失和神经元胞体内路易体的异常聚集为主要病理特征，临床表现为运动迟缓、肌肉僵硬、静息性震颤和姿势不稳等神经退行性运动障碍，严重影响患者的工作和生活。目前PD发病机制尚未明确，也缺乏有效治疗手段。神经炎症是驱动神经退行性病变的关键因素之一，已有研究证实，其在PD病理生理过程中发挥重要作用。在PD病理微环境下，α-突触核蛋白（α-syn）异常聚集、氧化应激及炎症因子等刺激可显著激活IκB激酶β（IKKβ），进而通过磷酸化降解IκB蛋白促使核因子κB（NF-κB）解离并转入细胞核内，启动下游促炎基因转录，大量释放白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎症因子，引发过度神经炎症；而持续放大的炎症反应又会进一步加剧多巴胺能神经元损伤、促进α-syn聚集与路易体生成，并形成恶性循环，推动神经退行性病变进展。由此可见，IKKβ/NF-κB信号通路可能是干预PD的重要潜在靶点。

刺五加苷B（ELB）是刺五加的主要活性成分之一，具有抗炎、抗脑缺血、抗衰老等多种生物学功能。现代研究表明，ELB可通过抑制脂多糖诱导的一氧化氮生成，降低炎症因子水平，发挥抗炎活性。笔者前期研究发现，刺五加有效组分具有神经保护作用，故推测ELB可能通过抑制IKKβ/NF-κB信号通路发挥该作用。为验证此假说，本研究采用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导小鼠PD模型，探讨ELB对多巴胺能神经元的保护作用，并基于IKKβ/NF-κB信号通路阐明其通过抑制炎症反应改善小鼠运动能力的机制，旨在为PD的治疗提供参考。

方法与结果

1.分组、造模与给药

将50只小鼠随机分为正常对照组、模型组、ELB低剂量组（80 mg/kg）、ELB高剂量组（160 mg/kg）和阳性对照组（盐酸司来吉兰片，10 mg/kg），每组10只，ELB给药剂量根据前期预实验结果设定，盐酸司来吉兰片剂量根据临床常用剂量换算。

小鼠自由适应性喂养1周后开始实验，从实验第1 d起，各给药组小鼠每天灌胃相应溶液，正常对照组和模型组小鼠灌胃生理盐水，给药体积为0.4 ml，连续14 d。从实验第10 d起，模型组和各给药组小鼠腹腔注射MPTP 30 mg/kg，连续5 d，诱导慢性PD模型；正常对照组小鼠腹腔注射生理盐水0.1 ml。

2.小鼠行为能力测试

（1）转棒实验

转棒实验根据相关报道加以改进后开展。实验第12 d每组随机选取6只小鼠进行行为学转棒训练。训练时，转棒疲劳仪的转速为15 r/min，每天训练120 s，连续训练3 d。末次给药24 h后进行正式测试，转棒疲劳仪的初始转速为4 r/min，最高转速为40 r/min，加速度为20 r/min，实验时间为5 min，记录从旋转开始到小鼠离开杆的时间，作为转棒停留时间。每只小鼠测试3次，两次测试间隔1 h，取均值，结果以正常对照组数值为标准进行归一化处理。

（2）爬杆实验

转棒实验结束后，选用长50 cm、直径1 cm的木杆子，进行爬杆实验。记录每组随机6只小鼠通过杆子爬到地板上的时间，并根据攀爬时间进行评分：＞6 s为1分，3～6 s为2分，＜3 s为3分。小鼠从杆子上掉落视为无效。每只小鼠测完后，均用75%乙醇溶液清洁木杆子。每只小鼠测试3次，取均值，结果以正常对照组数值为标准进行归一化处理。实验数据的最终产出环节（即评分与分析阶段）严格采用“单盲”评估。

3.样本采集

小鼠行为能力测试完成后，用乙醚麻醉并脱颈处死，快速摘取脑组织，于冰上分离脑黑质，备用。

4.脑组织中炎症因子水平检测

样本采集后每组随机6只小鼠脑组织，置于提前预冷的裂解液中冰浴30 min，以12 000 r/min离心5 min，取上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作，于酶标仪中检测吸光度值，并计算IL-1β、IL-10、TNF-α水平，结果以正常对照组数值为标准进行归一化处理。

5.脑黑质组织超微结构观察

每组随机6只小鼠部分脑黑质组织，置于2.5%戊二醛溶液中，于4℃固定过夜；次日取出并迅速切至米粒大小，转移至EP管内，用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液洗涤3次；随后于4℃下以1%锇酸固定2 h，经梯度乙醇逐级脱水后，置于环氧丙酮与环氧树脂（体积比为1∶1）混合液中浸透，以纯树脂包埋，制备超薄切片，贴附于铜网上；用醋酸铀染色20 min、枸橼酸铅染色15 min后，置于透射电子显微镜下观察超微结构。

6.脑组织中TH阳性表达检测

每组随机6只小鼠脑组织，用4%福尔马林溶液固定24 h，然后进行程序脱水、包埋、切片，按照DAB免疫组化试剂盒说明书操作，于倒置显微镜下观察并拍照，利用Image J软件分析棕黄色颗粒（TH阳性表达）的光密度（OD），结果以正常对照组数值为标准进行归一化处理。

7.脑组织中蛋白表达检测

每组随机提取6只小鼠脑组织中蛋白，测定浓度后，加热变性。取变性蛋白，电泳分离、转膜后，用5%脱脂牛奶封闭2 h，加入TH、α-syn、Iba-1、p-IKKβ、IKKβ、p-NF-κB p65、Lamin B1和GAPDH一抗（稀释比例分别为1∶1000、1∶1000、1∶2000、1∶2000、1∶2000、1∶2000、1∶2000、1∶2000），于37°C下孵育4 h；TBST洗涤3次后，再与辣根过氧化物酶标记的二抗（稀释比例为1∶2000）在37℃下孵育2 h；TBST洗涤后，加入ECL荧光检测剂，曝光显影后于一体式化学发光成像仪内扫描分析条带灰度值。以p-IKKβ/IKKβ和p-NF-κ酸化水平B p65/Lamin B表示，其余以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）蛋白的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。

8.脑组织中IL-1β、IL-10、TNF-α mRNA表达检测

每组随机6只小鼠脑组织中提取总RNA，逆转录成cDNA，并进行实时PCR扩增。PCR反应体系总体积为20 μL，包括cDNA模板2 μL，dNTP溶液1.6 μL，正、反向引物各0.8 μL，BeyoTaq Buffer溶液2 μL，BeyoTaq DNA Polymerase溶液0.1 μL，用双蒸水加至20 μL。PCR扩增条件为95℃预变性30 s；95℃变性5 s、60℃退火延伸31 s，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2－ΔΔCt法计算脑组织中IL-1β、IL-10、TNF-α mRNA的相对表达量，并以正常对照组数值为标准进行归一化处理。引物序列与扩增产物长度见表1。

表1 引物序列与扩增产物长度